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第一章 引言

第二章 综述

2.1 血管外科疾病概述

    2.1.1 血管外科疾病分类

    2.1.2 血管外科疾病病因及发病机制

    2.1.3 症状体征

    2.1.4 辅助检查

    2.1.5 诊断及治疗

2.2 血管内皮损伤机制研究

    2.2.1 血管内皮细胞损伤机制研究历程

    2.2.2 血管内皮损伤机制

2.3 分子影像学

    2.3.1 分子影像学及分子成像技术

    2.3.2 各分子成像技术简介

    2.3.3 多模态分子成像技术

2.4 本论文思想提出

第三章 血管活性物质SO2/HSO3-的荧光检测技术研究

3.1 引言

3.2 实验部分

    3.2.1 试剂与原料

    3.2.2 实验仪器

    3.2.3 实验方法

3.3 结果与讨论

    3.3.1 探针ISBD、ISPD和 ISND的检测性能对比实验

    3.3.2 探针ISND的响应时间

    3.3.3 探针ISND对 HSO3-的选择性和竞争性实验

    3.3.4 探针ISND分子的传感机理研究及理论化学计算

    3.3.5 探针ISND对血浆样品中HSO3-的浓度测定

    3.3.6 探针ISND的细胞毒性实验

    3.3.7 探针ISND的细胞成像实验

3.4 结论

第四章 活性氧(ClO-)的荧光检测技术研究

4.1 引言

4.2 实验部分

    4.2.1 试剂与原料

    4.2.2 仪器设备

    4.2.3 实验方法

4.3 结果与讨论

    4.3.1 pH值及响应时间

    4.3.2 裸眼识别及紫外-可见吸收光谱

    4.3.3 探针NAEC检测ClO-的荧光光谱

    4.3.4 竞争与干扰

    4.3.5 探针分子的传感机理研究

    4.3.6 血浆样品中ClO-的检测

    4.3.7探针NAEC的细胞毒性实验

    4.3.8 探针NAEC的体外细胞成像

4.4 结论

第五章 血管活性物质SO2/HSO3-与活性氧(ClO-)的双检测荧光成像技术研究

5.1 引言

5.2 实验部分

    5.2.1 试剂与原料

    5.2.2 仪器设备

    5.2.3 实验方法

5.3 结果与讨论

    5.3.1 pH值对探针NASF检测性能的影响

    5.3.2 探针NASF对 ClO-的紫外-可见吸收及荧光滴定

    5.3.3 探针NASF对 HSO3-的紫外-可见吸收及荧光滴定

    5.3.4 探针NASF对 ClO-和HSO3-的选择性及干扰性研究

    5.3.5 探针分子的传感机理研究

    5.3.6 血浆样品中HSO3-及ClO-的浓度检测

    5.3.7 探针NASF的细胞毒性

    5.3.8 生物应用:探针NASF的细胞成像检测

    5.3.9 生物应用:肿瘤细胞的识别

    5.3.10 生物应用:探针NASF活体肿瘤成像

5.4 结论

第六章 生物硫醇(Cys)的荧光检测技术研究

6.1 引言

6.2 实验部分

    6.2.1 试剂与原料

    6.2.2 仪器设备

    6.2.3 实验方法

6.3 结果与讨论

    6.3.1 响应时间与pH

    6.3.2 裸眼识别及紫外-可见吸收光谱

    6.3.3 荧光发射光谱

    6.3.4 探针CYNA对 Cys的干扰和竞争性研究

    6.3.5 探针分子的传感机理研究

    6.3.6 血浆样品中Cys检测

    6.3.7 探针CYNA的细胞毒性实验

    6.3.8 探针CYNA的细胞成像实验

    6.3.9 活体成像应用

6.4 结论

第七章 总结与展望

创新点

参考文献

附录

附录1

附录2

附录3

附录4

作者简介及博士期间所取得的科研成果

致谢

文章摘要:闭塞性动脉粥样硬化、动静脉血栓形成作为血管外科疾病中最主要、最常见两类疾病,其发生、发展与体内众多细胞因子有着千丝万缕的联系。血管内细胞功能障碍作为这两类疾病的始动环节,在疾病的整个进程中发挥着十分重要的作用。血管内皮细胞作为人体内最大的异质性“器官”,是血液与组织之间调控的关键界面,因此也成为了多种细胞活性物质的潜在作用靶点。虽然血管内皮细胞具备较强的自我修复能力,但在持续受到某些血管活性物质（NO、SO2）、活性氧（H2O2、O2-、Cl O-）、小分子生物硫醇（半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy））、炎症因子（白介素-17（IL-17）、血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1））、各种免疫因子、药物、微生物等作用下,内皮细胞对血管的保护作用减弱甚者消失,导致血管内皮细胞功能障碍（endothelial dysfunction ED）。其作为多种血管疾病的始动环节,主要通过调节血管收缩、促进白细胞粘附聚集、血小板凝聚、氧化应激损伤、平滑肌增殖及血栓形成等途径引发动脉粥样硬化,动静脉血栓形成等多种血管疾病。21世纪以来,随着科技进步,基因组学及蛋白质组学得到迅猛发展,人类对疾病发生、发展、评估治疗、改善预后也由传统的临床症状、体征、结构影像逐渐过渡到致病分子水平变化上来,医学影像技术也逐渐由结构成像、功能成像逐渐发展为分子成像。分子影像技术是运用新型影像学方法在细胞及分子水平对话活体状态下的生命过程,在分子及基因水平诊断及指导疾病治疗,从而达到个体化精准-可视化治疗,是分子生物学与多样化现代医学影像技术相结合的技术。因此,推动医学影像技术在临床血管疾病早期诊断及治疗中的应用具有重要意义。本论文围绕血管内皮损伤分子的荧光检测技术进行研究,通过设计合成高选择性、高灵敏性的小分子荧光探针,建立了血管内皮损伤重要相关分子（SO2、活性氧（Cl O-）、生物硫醇（Cys））的检测方法,考察了探针在细胞（体外）和小鼠活体（体内）成像中的应用情况,为指导相关临床血管疾病早期诊断、评估治疗疗效及改善预后提供了理论基础和实验依据。本论文主要包括以下四部分工作:1、从吲哚磺酸盐与不同结构的芳香醛出发,设计合成了3种能在纯水中检测SO2/HSO3-的新型荧光探针ISBD、ISPD、ISND,检测过程能在1min内快速完成,检测限分别为9.21×10-9mol/L（9.21 n M）、4.25×10-8 mol/L（42.5 n M）和8.11×10-8 mol/L（81.1 n M）。通过三种探针的性能比较,筛选出荧光强度更强（荧光量子产率更高）、发射波长更长、干扰性更小的荧光探针ISND。并对其抗干扰能力与生物检测能力进行了重点考察,发现17种干扰离子对于HSO3-的检测基本没有影响。细胞毒性及荧光实验也证实探针ISND毒性低、膜透性良好、能够完成血浆及细胞内复杂生物环境中的SO2/HSO3-检测,为进一步进行生物活体内实时成像奠定了基础,为今后临床工作中开展血浆SO2/HSO3-的水平监测提供了可行方案。2、以萘酰亚胺为荧光团,异氰基乙酸乙酯为识别基团,设计合成了一种用于生物环境内源性Cl O-检测的荧光探针NAEC。通过研究发现,该探针具有响应速度快（<10 s）、灵敏度高（检测限低至4.9 n M）、斯托克斯位移大（100 nm）等优点,能快速、灵敏、特异性的检测血浆及细胞中Cl O-浓度。竞争干扰实验证实,包括体内多种小分子生物硫醇及其他ROS在内的22种干扰物质对Cl O-的检测基本没有影响。此外,NAEC的膜透性较好,能够快速透过细胞膜进入细胞内部进行特异性Cl O-成像检测。同前面报导的探针ISND相比,探针NAEC的斯托克斯位移较大、能量利用率更高、发射波长更长,实现了细胞的内源性Cl O-的荧光检测。这不仅有助于荧光探针成为生命医学研究人员研究体内Cl O-分布和作用机制的有效工具,还能为动脉粥样硬化、动静脉血栓形成等血管疾病的早期诊断、个体化治疗、改善预后及术后内环境稳态监测等方面提供分子水平的重要参考。3、在前两部分内容基础上,充分利用吲哚磺酸盐的良好水溶性与萘酰亚胺基团的优异发光性能,设计合成了一种基于萘酰亚胺及吲哚磺酸盐结构的比率型双检测（HSO3-/Cl O-）的荧光分子探针NASF,该探针能够同时高灵敏度、高选择性完成HSO3-/Cl O-的定性及定量检测,实现一探针多用,并且在两种物质检测过程中产生不同波长的荧光信号,不会相互干扰。同前两部分的探针相比,探针NASF除了具有更大的斯托克斯位移（Cl O-:115 nm,HSO3-:88 nm）、较长的发射波长（Cl O-:515 nm,HSO3-:548 nm）、良好的水溶性（DMF/水=1:99,v/v）等优点以外,探针NASF作为比率型荧光探针,可以通过检测两个不同发射波长的荧光强度来提供内部自行校准,减少来自背景的干扰,能将探针浓度的影响降至最低,提高检测的精准度。体内、外成像实验发现,探针NASF可以很好的完成细胞内源性Cl O-的检测,无需外源性加入即可完成细胞内成像,同时在鉴别肿瘤细胞方面也具备良好的生物应用前景。但在进一步运用到活体肿瘤组织成像时表现乏力,这可能与探针NASF发射波长较短（λem=515 nm）、组织穿透能力较弱有关。研究显示:不同波长荧光组织穿透能力不同,生物组织在可见光区域（350-600 nm）有较高的光吸收。大部分荧光信号被动物毛发,皮肤等组织吸收、散射,难以完成高质量的活体荧光成像。当波长>600 nm时,各种波长的光对小鼠各器官的透过率将显著增加,在波长为650-900 nm的近红外区间,血红蛋白、脂肪、水对这些波长的光吸收均保持在较低水平。因此,选择激发和发射均位于近红外（650-900 nm）区域的荧光探针标记,更利于活体内可视化成像,特别是深层组织成像。4、鉴于第3部分内容中,探针NASF在活体成像中的欠佳表现以及近红外荧光成像在活体内的应用优势。结合临床实际应用,我们从目前唯一被美国FDA批准的临床使用的近红外光学成像对比剂-吲哚菁绿入手。对吲哚菁绿（ICG）化学结构进行优化改进,设计合成了一种新型荧光探针CYNA。该探针不仅可以实现Cys的特异、灵敏检测,同时还具备与吲哚菁绿相近的近红外成像能力,生物毒性低、组织相容性好、检测限达14 n M。探针NASF的激发波长和发射波长位于近红外I区（excitation:710 nm,emission:820 nm）,能够在出色完成细胞内源性Cys成像及血浆中Cys浓度测定的同时,大大提高了探针对活体组织的成像能力。活体成像实验中,我们通过静脉注射的方式将探针注射进小鼠体内,对探针的体内分布及代谢途径进行了初步研究。结果发现,静脉注射探针CYNA后,前60 min内,小鼠体内出现逐渐增强的近红外荧光信号;60 min以后,小鼠体内的荧光信号逐渐减弱;注射100 min后,荧光信号逐渐消失殆尽。另外,为了进一步探究实验小鼠体内荧光的聚集情况及信号来源,我们对不同时间节点小鼠的离体器官进行了荧光成像检测,发现荧光信号主要来自于肝脏及小肠,其他器官（心脏、肾、肺、脾）几乎没有可见荧光信号发出,荧光变化趋势与活体实验结果基本一致。根据以上实验结果,我们推测探针CYNA具有与ICG相类似的体内代谢途径,主要经肝脏代谢,并以游离形式进入肠道,进而随肠道排出体外。活体成像实验结果不仅证实探针CYNA可用于体内Cys的全身可视化研究,还将为下一步开展基于吲哚菁绿的新型淋巴显影剂的研发工作提供了理论基础及实验依据。

文章来源：《血管与腔内血管外科杂志》 网址: http://www.xgyqnxgwkzz.cn/qikandaodu/2021/1110/763.html